2019 AACR | 甲基化超深测序在肺癌早筛液体活检的突破性进展

发布时间:2019-08-26

肺癌作为全球最高致死原因的癌症,在2018年世界卫生组织发布的数据里,成为造成960万患者去世的病因。尽管近几十年来,肺癌的诊断和治疗都有了突出的进展,但相比乳腺癌、甲状腺癌等癌种,预后仍然不容乐观。肺癌早期患者(局部病灶)的五年生存率为55%,而出现远处转移的晚期患者仅有4%。

 

由于观念、筛查手段的便捷性和技术限制等问题,肺癌早筛早检仍需更加有效、便捷的方法。

 

随着二代测序(NGS)技术的不断发展,循环肿瘤DNA(ctDNA)的突变检测在肺癌的诊断、监测和预后中,体现了强大的应用前景。而在肿瘤早筛早检领域,目前,早期肿瘤的检测空间依然局限在ctDNA含量非常丰富的癌种,例如肝癌(早期肝癌中位ctDNA含量>10%)。而肺癌,尤其是非小细胞腺癌,早期的ctDNA远低于0.1%:

 

早期患者的10ml血液里,即使在超深测序(>10,000X),有效分子数通常也<4000个,加上抽样误差和测序错误带来的背景噪音,业内称为“observation dilemma”(观测次数困境),都令实现对超低丰度ctDNA的检出充满困难。

 

为了突破低频基因突变的瓶颈,ylzzcom永利总站研发团队在各种早期肿瘤标识物中,采用了DNA甲基化作为突破口。和肿瘤基因突变相比,DNA甲基化具有如下特点:

(1) 是肿瘤早期发展的标志性改变;

(2) 特征位点众多,而且在基因组上有“成簇”效应;

(3) 具有特异的“图案”和“水平”,增加信噪比;

(4) 具有器官特异性,使肿瘤发生位置溯源成为可能。

这些特质使得表观组学的研究,成为肿瘤早期发现的强大潜力标识。

 


正在举行的2019年AACR年会,ylzzcom永利总站壁报为参会专家展示了ELSA-seq,一种ylzzcom永利总站开发的超敏感ctDNA甲基化分析方法用于肺癌早筛探索的研究数据。本次研究ylzzcom永利总站与UC Berkeley、北京协和医院和上海胸科医院合作,结果显示:

以单碱基分辨率捕获肿瘤相关表观遗传学改变,用于肺癌早期无创检测具有令人兴奋的应用前景!   

 

基于ELSA-seq方法,最少仅需1ng的游离血浆 DNA(cfDNA),便可以成功制备足够的单碱基分辨率的测序文库。ylzzcom永利总站根据公共数据库的挖掘(肿瘤=4772,正常=411,白细胞=656)和ylzzcom永利总站内甲基化组测序数据库的结果,筛选出代表性的80,637个肺癌和泛癌种的差异性甲基化位点(DML)设计重叠捕获探针,探测血液中肿瘤相关甲基化变异。

 

高效准确的ssDNA建库和靶向捕获,奠定了ELSA-seq超深甲基化测序的基础——在6,000X的中位测序深度下,有效测序量依然攀升,使得针对低频信号的抽样误差、PCR扩增以及测序的错误的有效矫正成为可能。

 

 

ylzzcom永利总站研发团队对ELSA-seq设计了详细的性能分析(analytical performance),在模拟数据中,ELSA-seq检测敏感性达到0.00001(10万分之1),在肿瘤细胞掺比试验中,多个操作者多次重复,敏感性依然稳定达到0.0005(万分之5)。和传统抗体捕获,或者酶切型甲基化测序比较,ELSA-seq更表现出了可喜的可重复性。


 

为了验证该方法的临床有效性(clinical validation),研究者将ELSA-seq应用于两个独立的队列,共398名早期肺癌患者(78%为I期患者),和501名健康个体:

  • 来自中心1的队列:随机分成训练组(n=314)和holdout验证组(n=309);
  • 来自中心2的独立测试组:样本收集、处理以及数据分析完全独立,病理结果直到分析结束才被给出。

 

 

在本研究中,针对I/II/III期的非小细胞肺癌患者和健康人群,达到了64%、80%和87%的敏感性,96%的特异性,显著优于目前报道过的基于血液的肺癌早筛平台。

 

这也是国内外针对肺癌早期患者最大的ctDNA甲基化超深测序队列。

 

图A. 训练样本集检测结果(左)和ROC曲线(右),n=314

训练集的AUC=0.93(95% CI:0.88,0.95),显示了有效的模型训练。

 

图B. 验证样本集检测结果(左)和按病理分期分组的各样本的预测概率(右),n=309

Holdout验证集的分类效果近似,而且预测概率随着肿瘤stage进展而不断升高,符合生物学特征,显示了模型对feature的准确模拟和对overfitting的有效控制。 


图C. 独立测试组检测结果(左)和部分患者基因突变检测结果(>10,000X)平行比对(右)

 

在具有足够血浆的28个早期肺癌患者中,进行了甲基化和体细胞突变的双重检测,ELSA-seq成功检出27个病患(27/28),其中16个有明确的体细胞突变检出,再次验证了甲基化超深测序的高灵敏性。

 

ELSA-seq在双中心临床验证的结果表明(n=899):早期肺癌在血浆中的信号可以被超深甲基化靶向测序捕获,大样本训练后的机器学习模型准确性和可泛化性良好,预示着在临床环境中使用的巨大潜力。

 

ylzzcom永利总站研发副总监 李冰思

 

从科学研究到临床产品需要走过一条漫长的验证之路,ylzzcom永利总站的研发与医学团队将继续进行基于DNA甲基化的肿瘤早筛产品的开发、优化与大队列临床验证。希望在不久的未来,更好的检测技术可以开始把肿瘤早诊早筛带入新时代。

 

关于AACR年会

AACR年度每届都会涵盖癌症研究领域的最新发现——从大众科学到疾病预防、癌症生物学、转化和临床研究——并会展示世界各地研究和医学机构的卓越工作成果。